如何評(píng)價(jià)SEM圖片的質(zhì)量？這是一個(gè)頗為復(fù)雜的問(wèn)題，涉及到主觀因素。SEM圖的解讀需要觀察者根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)進(jìn)行分析和判斷，其中觀察者的主觀偏見(jiàn)或期望可能會(huì)影響對(duì)圖像的解讀，比如刻意避開(kāi)不理想的區(qū)域，選擇局部OK區(qū)域來(lái)代表自己的預(yù)期。
如果忽略主觀因素，那怎么才算一張高質(zhì)量的SEM照片呢？
從視覺(jué)感受出發(fā)：1.要具備高分辨能力，能夠清晰地顯示樣品的細(xì)節(jié)和顯微結(jié)構(gòu)，邊界銳利，不模糊。2.襯度適中，突出樣品的特征，使不同部分易于區(qū)分。3.低噪聲，具有足夠的信噪比，實(shí)現(xiàn)圖像細(xì)節(jié)的高清度（注意，這個(gè)和分辨率還不是一個(gè)概念，可以理解為單位像素點(diǎn)上束流密度變大了）。4.無(wú)失真，尤其是在低倍數(shù)下，保持樣品的原始形狀和比例，避免圖像扭曲或變形，有助于進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量和分析。5.足夠的景深，對(duì)于具有層次感的樣品，譬如多孔材料或金屬斷口，需要使整個(gè)樣品都能清晰成像，而不僅僅是表面。6. 要有代表性，能夠準(zhǔn)確地代表樣品的整體特征，不是局部或異常的表現(xiàn)，這對(duì)于得出可靠的結(jié)論和進(jìn)行比較研究很關(guān)鍵。7.準(zhǔn)確的標(biāo)注：包括哪種放大倍數(shù)，工作距離，探測(cè)器等必要的標(biāo)注，使其他人能夠理解圖像的相關(guān)參數(shù)信息，有助于圖像的交流和引用。8.符合研究目的：能夠滿足研究或分析的特定需求，與研究問(wèn)題或目標(biāo)相關(guān)，能為研究提供有價(jià)值的信息和證據(jù)。
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圖1 陶瓷過(guò)濾膜截面。低加速電壓不鍍金成像，可辨別支撐體上不同孔尺寸的3層過(guò)濾膜，膜層顆粒堆積的形態(tài)以及顆粒表面細(xì)節(jié)。圖注：著陸電壓500V，減速電壓2KV，束流25pA,賽默飛Apreo2T1探測(cè)器。
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圖2 陶瓷過(guò)濾膜截面。低加速電壓不鍍金成像，可清楚的辨別支撐體上不同孔尺寸的2層氧化鋯過(guò)濾膜，膜層顆粒堆積的形態(tài)。圖注：5KV，束流50pA,賽默飛Apreo2 T1 探測(cè)器。
有了以上SEM照片質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，那么，對(duì)于電鏡操作員來(lái)說(shuō)，如何獲得高質(zhì)量的圖片呢？
這也是一個(gè)比較復(fù)雜的問(wèn)題，細(xì)分來(lái)說(shuō)，可以從以下幾個(gè)角度考慮：1.樣品制備，2選擇合適的儀器參數(shù)，比如加速電壓，工作距離，束流大小等，3.聚焦和合軸，4.選擇合適的探測(cè)器，5.選擇合適的掃描速度，6圖像的后期優(yōu)化處理。
總的來(lái)說(shuō)，需要通過(guò)實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)積累，掌握如何調(diào)整參數(shù)和優(yōu)化成像條件。同時(shí)注意觀察圖像中的細(xì)節(jié)和異常，及時(shí)調(diào)整參數(shù)以獲得更好的結(jié)果。另外，作為初學(xué)者，需要與有經(jīng)驗(yàn)的SEM操作人員、研究人員或工程師交流，從他們那里獲得經(jīng)驗(yàn)和技巧。也可以積極參加培訓(xùn)課程或研討會(huì)，提高自己的技能水平。
下面將基于樣品制備和設(shè)備參數(shù)調(diào)整與操作的角度，就如何獲取高質(zhì)量的SEM圖片進(jìn)行闡述。
1、樣本制備
要獲取高質(zhì)量的圖片，樣品制備至關(guān)重要。處理不當(dāng)?shù)臉悠窌?huì)導(dǎo)致觀察假象，對(duì)于大多數(shù)樣品的要求是，應(yīng)干燥且導(dǎo)電，以獲得效果。
首先因?yàn)橛^察的對(duì)象不同，有生物樣品，也有材料樣品，因此，并非所有SEM都使用相同的樣品制備順序。此外，SEM的具體步驟取也決于具體的設(shè)備類型，以下是一些常規(guī)的流程和注意事項(xiàng)，旨在簡(jiǎn)單闡述制備樣品的過(guò)程。
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圖3 SEM樣品制備的流程：干燥樣品和含水樣品。
SEM中生物樣品的制備步驟一般包括：1取材：選擇合適的生物樣本；2清洗：去除表面的雜質(zhì)；3固定：使用化學(xué)試劑固定樣本；4脫水：通過(guò)梯度脫水處理；5干燥：選擇適當(dāng)?shù)母稍锓椒ǎ?鍍膜：通常使用金、鉑等金屬進(jìn)行鍍膜，增加導(dǎo)電性；7.觀察：將制備好的樣品放入SEM中進(jìn)行觀察。
在整個(gè)制備過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：盡量保持樣本的原始結(jié)構(gòu)和形態(tài)。控制每個(gè)步驟的條件，以確保樣品的質(zhì)量。避免污染和損傷樣品。
1.1 生物樣品：固定
含水樣品主要涉及到生物類樣品，生物樣品通常具有高含水量。如果樣品未經(jīng)特殊處理就放入SEM真空中，由于真空會(huì)將水從樣品中抽出，樣品結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p壞，同時(shí)也會(huì)污染SEM樣品倉(cāng)。對(duì)于這類樣品，簡(jiǎn)單的風(fēng)干或加熱干燥方法并不合適，因?yàn)樵诟稍镞^(guò)程中樣品會(huì)發(fā)生變化(想想生活中，葡萄和葡萄干之間的區(qū)別)。
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圖4 葡萄與葡萄干，結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變
生物樣品的制備步驟通常通常需要復(fù)雜且周期長(zhǎng)，包括固定、脫水和干燥。一旦樣品完全干燥，就可以將其安裝在SEM樣品上，然后鍍膜或者不鍍膜觀察。
生物樣品的制備流程主要涉及以下步驟：
化學(xué)固定（Chemical fixation）：化學(xué)固定法是將樣品浸入化學(xué)固定液中。通常使用的是含3%戊二醛在0.1M 緩沖溶液（如Sorrenson磷酸鹽緩沖溶液），PH值取決于組織，植物組織通常使用6.8，動(dòng)物組織通常使用 7.2-7.4。磷酸鹽緩沖液無(wú)毒，戊二醛可交聯(lián)蛋白質(zhì)，使樣品更堅(jiān)硬。
組織一般在固定液中浸泡1-2小時(shí)（取決于樣品大小），溫度為4℃，有時(shí)也可在室溫下浸泡。然而，用于SEM的樣品可在固定液中存放數(shù)周而不會(huì)明顯降解。使用帶有散熱片的 BioWave 微波爐可加快固定過(guò)程。
一次固定后通常會(huì)用緩沖液清洗，然后進(jìn)行第二次化學(xué)固定，以穩(wěn)定部分脂質(zhì)成分（脂肪酸）。在室溫下（在通風(fēng)櫥內(nèi)！），將1%的四氧化鋨溶于緩沖液（如 0.1M 的可可堿緩沖液）中1到2小時(shí)。
對(duì)于只關(guān)注外部結(jié)構(gòu)的SEM來(lái)說(shuō)，較大的組織塊通常不需要長(zhǎng)時(shí)間固定，因?yàn)閮?nèi)部固定不佳并不那么重要。固定后，樣品需要在乙醇中逐級(jí)脫水，然后通過(guò)臨界點(diǎn)干燥（CPD）或冷凍方法干燥。
備注：在 SEM 生物樣品制備的梯度脫水過(guò)程中，常用的乙醇或丙酮濃度依次為：30%乙醇或丙酮：浸泡一段時(shí)間。50%乙醇或丙酮：再浸泡一段時(shí)間。70%乙醇或丙酮：繼續(xù)浸泡。90%乙醇或丙酮：浸泡一定時(shí)間。100%乙醇或丙酮：脫水。
具體的濃度參數(shù)可能因生物樣品的類型、大小和特性而有所不同。
蒸汽固定（Vapour fixation）：不是所有的樣品都適合化學(xué)固定，有些樣品就很容易損壞，因此不可能浸入液體中。這對(duì)于真菌及其子實(shí)體(分生孢子)來(lái)說(shuō)尤其如此，它們?cè)诮佑|時(shí)會(huì)從母體植物中分離出來(lái)。
蒸汽固定使用一滴固定劑，放在密封容器中靠近樣品的地方。在切下的受感染的葉片材料的情況下，用4%的四氧化鋨水溶液，在大約1小時(shí)內(nèi)固定樣品。樣品固定后會(huì)變黑，這有助于評(píng)估進(jìn)度。一旦固定，樣品可以放在用液氮冷卻的金屬塊上冷凍，然后冷凍干燥。
冷凍固定（Cryofixation）：快速冷凍含有液體或水的樣品會(huì)使液體變成固體，而不會(huì)形成很多晶體。有許多冷凍樣品的裝置。高壓冷凍的技術(shù)，可以產(chǎn)生的形態(tài)，但是它們需要極小的樣品量（非常適用于TEM）。對(duì)于SEM來(lái)說(shuō)，將樣品放入液氮流體或液氮泥漿中通常就足夠了，或者可以將在SEM樣品倉(cāng)中通過(guò)冷臺(tái)來(lái)冷凍樣品。
一旦冷凍，樣品就可以很容易地觀察樣品的原始形貌，這也可以避免切割軟材料造成的損壞。通常需要在冷凍樣品上鍍上一層金屬觀察。冷凍樣品可以在冷凍狀態(tài)下保存很長(zhǎng)時(shí)間，這個(gè)流程涉及到的安全問(wèn)題包括凍傷和氮?dú)庵舷ⅰ?/span>
1.1 生物樣品：干燥
冷凍干燥（freeze drying）：冷凍干燥通過(guò)蒸發(fā)除去樣品中的冷凍水，也就是說(shuō)，水分子沒(méi)有先轉(zhuǎn)化為水就從冰中消失了，這個(gè)過(guò)程很慢，但如果做得好，通常可以讓樣品保持完好和完全干燥。優(yōu)點(diǎn)是避免了危險(xiǎn)的化學(xué)固定劑。
樣品一般放在大型預(yù)冷金屬塊的凹陷處，一旦進(jìn)入冷凍干燥室，就打開(kāi)真空，讓機(jī)器在零下30度左右運(yùn)行3天左右。
需要注意的是，因?yàn)楦稍锖髽悠返闹亓勘缺容^輕，所以在干燥過(guò)程結(jié)束時(shí)，必須小心將空氣引入室內(nèi)，否則樣品會(huì)被風(fēng)吹走而丟失。
臨界點(diǎn)干燥（Critical point drying，CPD）：樣品中的水逐漸被乙醇取代，乙醇隨后被液態(tài)二氧化碳取代。然后增加容器的壓力和溫度，直到CO2達(dá)到臨界點(diǎn)，從液相變成氣相。這樣可以避免風(fēng)干過(guò)程中造成的損壞，從而保護(hù)樣品結(jié)構(gòu)。
化學(xué)干燥（Chemical-drying）：CPD的替代方法是使用六甲基二硅烷或HMDS，沒(méi)有水的擠壓表面張力，甚至沒(méi)有乙醇蒸發(fā)造成的損害。
溶劑(優(yōu)選乙醇)中的樣品可以作為50:50的溶液引入HMDS，然后變成100% HMDS (2次變化)。更換時(shí)，可以將溶液排干，直到剛好蓋住樣品，然后放在通風(fēng)柜中蒸發(fā)。對(duì)于非常小的樣品，這可能需要幾分鐘的時(shí)間，對(duì)于較大的樣品，這可能需要幾天的時(shí)間。
對(duì)于不適合CPD室的大樣品，或者載玻片/硅片上的樣品，這是CPD的有用替代方法。然而，并非所有來(lái)自HMDS的樣品都能成功干燥。此外，為了安全起見(jiàn)，不要吸入HMDS蒸汽，也不要將任何混有乙醇的溶液儲(chǔ)存在封閉的瓶中，因?yàn)檎羝麎毫?huì)增加并導(dǎo)致爆炸。
此外，高分子聚合物樣品可以是濕的，也可以是干的。如果它們是濕的(或含有大量的水或液體),則需要在SEM檢測(cè)之前進(jìn)行干燥。高分子聚合物材料通常不需要進(jìn)行固定，但必須清除其中的液體。凝膠類多孔高分子聚合物樣品，通常采用冷凍干燥，一旦樣品完全干燥，就可以將其安裝在樣品臺(tái)上，然后鍍膜或不鍍膜觀察。
1.2 材料樣品的表面觀察
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圖5 不同材料的樣品制備方法：觀察表面
1.3 材料樣品的截面觀察
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圖6 不同材料的斷面制備方法：觀察斷面
我們關(guān)注材料的信息，通常是關(guān)注樣品的表面或內(nèi)部細(xì)節(jié)，因此以上也針對(duì)不同材料的表面和斷面制備進(jìn)行了簡(jiǎn)單的總結(jié)，這里就不再對(duì)各工藝細(xì)節(jié)進(jìn)行詳細(xì)的闡述。后續(xù)也會(huì)有專題對(duì)樣品制備進(jìn)行就行詳盡的討論。
制備好的SEM樣品附著在樣品臺(tái)上，這也是制備樣品的一個(gè)非常重要的部分。因?yàn)镾EM是一種表面成像技術(shù)，感興趣的樣品部分必須朝上，對(duì)于塊狀樣品，樣品表面和樣品臺(tái)底座之間必須有連續(xù)的通路（通常會(huì)用導(dǎo)電膠或?qū)щ姖{料架起導(dǎo)電橋梁，再鍍導(dǎo)電膜），這樣電荷就不會(huì)積聚。
圖7 盡量讓塊體或大顆粒粉末狀樣品跟金屬襯底保持導(dǎo)電通路
要使用SEM，必須首先將樣品放入樣品室。由于樣品室保持真空，必須將干燥的空氣或氮?dú)庖霕悠肥遥员愦蜷_(kāi)樣品室并將樣品放在載物臺(tái)上。盡量不要讓樣品倉(cāng)門(mén)開(kāi)太久，如果腔室沒(méi)有保持在真空下，抽氣時(shí)間會(huì)增加，并且長(zhǎng)期這樣操作，污染會(huì)在腔室內(nèi)慢慢積聚。
2儀器參數(shù)的調(diào)整
為什么要調(diào)整儀器參數(shù)？首先，優(yōu)化圖像質(zhì)量，通過(guò)調(diào)整參數(shù)，可以獲得更清晰、更詳細(xì)的圖像。其次，適應(yīng)樣本特性，不同的樣本可能需要不同的參數(shù)設(shè)置。第三，提高分辨率，以更好地分辨樣本的微觀結(jié)構(gòu)。第四，控制電子束強(qiáng)度，避免對(duì)樣本造成過(guò)度損傷。第五，調(diào)整襯度，增強(qiáng)圖像的襯度，便于觀察。第六，優(yōu)化景深使整個(gè)樣本都能清晰成像。第七，適應(yīng)不同的放大倍數(shù)，確保在不同放大倍數(shù)下都能獲得良好的圖像。
2.1 加速電壓
理論上，加速電壓的增加將使SEM圖像中的信號(hào)更多、噪聲更低。但實(shí)際情況并非如此簡(jiǎn)單。高加速電壓成像有一些缺點(diǎn): 1. 高加速電壓可穿透較厚的樣品，但在SE模式下，對(duì)樣品表面結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的分辨能力降低，低加速電壓則適用于表面成像；2絕緣樣品中的電子堆積增加，造成更嚴(yán)重的充電效應(yīng)；3 在樣品中傳導(dǎo)的熱量會(huì)增加，可能導(dǎo)致樣品損傷，尤其是對(duì)熱敏感的材料。
加速電壓越高，電子束穿透力越強(qiáng)，相互作用體積越大，背散射電子（BSE）的數(shù)量也會(huì)增加。對(duì)于典型電壓（如15KV）下的二次電子（SE）成像，BSE會(huì)進(jìn)入二次電子探測(cè)器，并降低分辨率，因?yàn)樗鼈儊?lái)自樣品的更深處。
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圖8 不同加速電壓下，電子束與樣品的相互作用體積不一樣，高加速電壓穿透的更深
加速電壓是燈絲和陽(yáng)極之間的電壓差，主要用于加速電子束向陽(yáng)極移動(dòng)。典型SEM的加速電壓范圍為1KV至30KV。電壓越高，電子束穿透樣品的能力就越強(qiáng)。
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圖9 不同加速電壓帶來(lái)的成像效果差異。1KV加速電壓下，呈現(xiàn)更多的表面細(xì)節(jié)。賽默飛Apreo2 T1 探測(cè)器。
下表中提供了選擇加速電壓的一般操作指南。當(dāng)然，不同的電鏡設(shè)備，即使參數(shù)相同，成像效果也會(huì)有差異，要確定樣品成像的設(shè)置，需要進(jìn)行實(shí)踐操作。
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圖10 加速電壓選擇的一般操作指南。對(duì)于電子束敏感材料以及需要觀察樣品極表面細(xì)節(jié)的樣品，通常需要更低的電壓和更低的束流。
2.2 光闌
光闌是金屬條上的一個(gè)小孔，它被放置在電子束的路徑上，以限制電子沿鏡筒向下運(yùn)動(dòng)。光闌可阻止偏離軸線或能量不足的電子沿柱子向下運(yùn)動(dòng)。根據(jù)所選光闌的大小，它還可以縮小光闌下方的電子束。
圖11 物鏡光闌對(duì)電子束路徑的影響示意圖
物鏡 (OL) 光闌：該光闌用于減少或排除外來(lái)（散射）電子。操作員應(yīng)選擇的光闌，以獲得高分辨率的SE圖像。
物鏡光闌安裝在SEM物鏡的上方，是一根金屬桿，用于固定一塊含有四個(gè)孔的金屬薄板。在它上面裝有一個(gè)更薄的矩形金屬板，上面有不同大小的孔（光闌）。通過(guò)前后移動(dòng)機(jī)械臂，可以將不同大小的孔放入光束路徑中。這都限于老式掃描電鏡，現(xiàn)代電鏡通過(guò)靜電偏轉(zhuǎn)到想要的孔，不是機(jī)械移動(dòng)。
圖12 機(jī)械臂上有一個(gè)細(xì)金屬條，上面有不同大小的孔，這些孔與較大的孔對(duì)齊，該金屬條被稱為光闌條。孔直徑從20微米到1000微米不等
大光闌可用于低倍成像以增加信號(hào)，也可用BSE成像和EDS分析工作。小光闌用于高分辨率工作和更好的景深，但缺點(diǎn)是到達(dá)樣品的電子較少，因此圖像亮度和信噪比較低。
下表列出了一些光闌大小和實(shí)際用途的例子。不同光闌可使用數(shù)字刻度。例如，可以使用1、2、3和4。根據(jù)儀器的不同，可以用的數(shù)字表示的光闌直徑，也可以用的數(shù)字表示小的光闌。
在SEM設(shè)備校準(zhǔn)過(guò)程中，為了生成良好的圖像，需要檢查光闌，以確保其圍繞光束軸居中，這可以通過(guò)使用晃動(dòng)（Wobbler）控制來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)圖像左右移動(dòng)，則需要在 X 或 Y方向（進(jìn)出或左右移動(dòng)）調(diào)整光闌，調(diào)整時(shí)只需微微旋轉(zhuǎn)相應(yīng)的旋鈕，直到圖像停止移動(dòng)為止。當(dāng)電子束直徑在樣品表面達(dá)到小值時(shí)，聚焦效果好。圖像應(yīng)清晰明確。
2.3 束斑尺寸
電子束錐在樣品表面形成的束斑大小（橫截面直徑）會(huì)影響：1）圖像的分辨率；2）產(chǎn)生的電子數(shù)量，從而影響圖像的信噪比和清晰度。在低倍放大時(shí)，我們使用的束斑尺寸要比高倍放大時(shí)大。
圖13 不同束斑大小對(duì)圖像分辨率的影響
當(dāng)在相同的放大倍率、電壓和工作距離下使用不同的束斑尺寸拍攝圖像時(shí)，很容易看出不同系列圖像在模糊度（分辨率）上的差異。表達(dá)束斑大小的方式取決于所用電鏡的廠家和型號(hào)。
下圖是在三種不同束斑尺寸下拍攝的硅藻。在束斑尺寸（束斑5）下，圖像顯示的細(xì)節(jié)少于小束斑尺寸（束斑1）。不過(guò)，在小束斑尺寸下，圖像的信噪比有所降低。
圖14 三種不同束斑尺寸下拍攝的硅藻
對(duì)于任何一個(gè)放大倍率，停留點(diǎn)（圖中一行中的光點(diǎn)）的數(shù)量都是恒定的，因此束斑點(diǎn)尺寸太小會(huì)導(dǎo)致沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生的間隙，束斑尺寸太大會(huì)導(dǎo)致信號(hào)重疊和平均。
束斑尺寸會(huì)隨著一些參數(shù)的改變而改變。例如，長(zhǎng)工作距離（WD）下的束斑尺寸比短WD的大。物鏡光闌越小，束斑尺寸越小。此外，無(wú)論使用哪種 WD，聚光透鏡流過(guò)的電流越大（激勵(lì)強(qiáng)，聚焦效果好），樣品上的束斑就越小。
因此，當(dāng)WD較小、聚光透鏡激勵(lì)較高、光闌較小時(shí)，我們就能實(shí)現(xiàn)小的束斑尺寸。這三個(gè)參數(shù)是相互影響的，需要仔細(xì)權(quán)衡，才能獲得圖像，因?yàn)樗鼈冞€會(huì)影響其他參數(shù)，如焦距和電子信號(hào)強(qiáng)度。
2.4 工作距離（WD）：分辨率與景深
樣品工作距離 (WD) 是指SEM鏡筒極靴底部與樣品頂部之間的距離。在樣品室中，樣品臺(tái)可以上升到更靠近極靴的一端（工作距離短），也可以下降到更低的位置（工作距離長(zhǎng)）。
圖15 工作距離（WD）示意圖
工作距離越短，樣品表面的電子束直徑就越小。因此，在可能的情況下，工作距離應(yīng)保持在10毫米或更小，以獲得高分辨率成像。但小工作距離的缺點(diǎn)是，會(huì)大大降低景深。雖然可以通過(guò)使用較小的物鏡光闌來(lái)抵消這種不利因素，但同時(shí)也帶來(lái)電子束流密度的降低（圖像看起來(lái)顆粒感更強(qiáng)，不夠細(xì)膩）。
備注：對(duì)于ET探測(cè)器來(lái)說(shuō)，縮短WD帶來(lái)高分辨率的效果是不夠顯著的。對(duì)于大部分鏡筒內(nèi)電子探測(cè)器，縮短WD能顯著提高分辨率。這也是我們經(jīng)常看到，高倍數(shù)的照片都是在短WD下拍攝的，極端情況下，WD可以＜1mm。
在許多 SEM 中，外部工作距離 (Z) 控制桿可用于升高或降低試樣，該值通常被誤認(rèn)為是準(zhǔn)確的工作距離。然而，真正的工作距離 (WD)是以電子方式測(cè)量的，即樣品表面聚焦點(diǎn)到極靴下表面的距離。外部Z控制（機(jī)械控制）值與圖像屏幕上提供的 WD 值不同有三個(gè)原因。
只有當(dāng)電子束準(zhǔn)確聚焦到試樣表面時(shí)，"屏幕上"的 WD 值才是準(zhǔn)確的測(cè)量值。聚焦不足或聚焦過(guò)度的圖像會(huì)提供虛假的WD值以及模糊的圖像。
外部Z值和準(zhǔn)確聚焦試樣的真實(shí) WD 值會(huì)有所不同，因?yàn)檫@兩個(gè)測(cè)量值可能是從試樣架上的不同點(diǎn)測(cè)量的。試樣如果不是均勻平整的，不同的形貌特征會(huì)有不同的真實(shí)WD。
WD會(huì)影響SEM圖像的景深和分辨率。隨著WD的增加，電子束發(fā)散角會(huì)減小，從而提供更大的景深。增加WD的"代價(jià)"是，電子束必須從掃描移動(dòng)更遠(yuǎn)的距離，因此在試樣上的束斑尺寸更大。
景深是指試樣在肉眼看來(lái)可接受的聚焦垂直范圍。在SEM中，圖像景深的 "范圍 "通常比光學(xué)顯微鏡大上百倍，因此許多SEM顯微照片幾乎都是三維的。
圖16 不同工作距離帶來(lái)的景深效果不一樣，WD越大，景深越好
2.5 圖像的襯度和亮度
SEM圖像是根據(jù)從樣品材料中射出的電子數(shù)來(lái)構(gòu)建的強(qiáng)度圖（數(shù)字或模擬）。SEM中每個(gè)駐留點(diǎn)的電子信號(hào)以像素的形式在屏幕上逐行顯示，從而形成圖像。每個(gè)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度反映了從形貌或成分中產(chǎn)生的電子多少。通過(guò)信號(hào)處理，每個(gè)電子的信號(hào)信息（從光束的每個(gè)駐留點(diǎn)獲得）都可以在顯示之前被轉(zhuǎn)換成與原始值有嚴(yán)格關(guān)系的新值。這樣，我們就可以通過(guò)調(diào)整信號(hào)來(lái)改變圖像的襯度和亮度。
在大多數(shù)情況下，未經(jīng)處理的圖像包含足夠的"自然襯度"，操作員可以從圖像中提取有用的信息。自然襯度可被視為直接來(lái)自樣品和探測(cè)器系統(tǒng)的信號(hào)中包含的襯度。如果自然襯度過(guò)低或過(guò)高，則可能會(huì)丟失與重要細(xì)節(jié)相對(duì)應(yīng)的信號(hào)變化。
在這種情況下，我們會(huì)看到圖像中有很多黑色或白色區(qū)域。質(zhì)量好的圖像具有灰度漸變，只有極少部分是全黑或全白的。信號(hào)處理技術(shù)可以處理自然襯度，使眼睛可以通過(guò)圖像中的襯度感知信息。雖然信號(hào)處理技術(shù)允許用戶對(duì)自然襯度進(jìn)行處理，但并沒(méi)有增加信息，只是增強(qiáng)了已有的信息（因此，這種圖像處理技術(shù)不屬于對(duì)已有信息的篡改）。
以下這幅圖像左側(cè)襯度太低，右側(cè)襯度太高，中間的圖像襯度是合適的。左邊的圖像可以后期調(diào)整，方法是在Photoshop軟件中修改灰度 "色階"的分布，但右圖像無(wú)法修正，因?yàn)槭羌兒诎讌^(qū)域的（無(wú)法從這些區(qū)域獲取更多數(shù)據(jù)）。
圖17 圖像襯度對(duì)比
應(yīng)該注意的是，信號(hào)處理會(huì)極大地改變圖像的外觀，使其與通常預(yù)期的不同，因此SEM操作員有義務(wù)說(shuō)明是否進(jìn)行了處理。不過(guò)，通常情況下，使用襯度和亮度旋鈕調(diào)整圖像質(zhì)量是被認(rèn)可的圖像處理流程。但是，如果為了使SEM圖像看起來(lái)更清晰而進(jìn)行了一些其他處理，則應(yīng)在正式報(bào)告中說(shuō)明具體的處理的方式。
舊型號(hào)的SEM一般都需要手動(dòng)調(diào)整襯度和亮度。更現(xiàn)代的機(jī)器則依靠軟件程序自動(dòng)調(diào)節(jié)，輔以機(jī)器操作員的喜好：一鍵操作，提高工作效率。但需要注意的是，人眼對(duì)圖像襯度和亮度的感知或?qū)徝溃蛙浖?jì)算的結(jié)果并不一致，因?yàn)闉榱烁玫膱D片質(zhì)感，還需要依賴手動(dòng)調(diào)節(jié)。
傾斜樣品可以增加SE襯度：增加SE襯度的另一種方法是傾斜樣品，使其與探頭成一定角度（通常為 30° 至 60°）。傾斜的結(jié)果是，每單位投影試樣面積會(huì)產(chǎn)生更多的 SE，從而使亮部和暗部的分布更加明顯，從而增強(qiáng)襯度。
2.6 放大和校準(zhǔn)
放大是指放大圖像或圖像的一部分。在SEM中，放大是通過(guò)掃描較小的區(qū)域來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在圖像中，樣品上的電子束用箭頭表示。
當(dāng)掃描到一個(gè)較小的區(qū)域時(shí)，我們看到的是物體變大了。以下的顯微圖像的放大倍數(shù)從 900倍到 10000 倍不等。
圖18 隨著掃描區(qū)域的不同，放大倍數(shù)也會(huì)隨之改變
圖像的放大倍數(shù)通常會(huì)在屏幕上給出一個(gè)數(shù)值（如2000x）。圖像上還會(huì)有一個(gè)刻度條，代表精確的距離單位。
在掃描電鏡中，通常涉及到兩個(gè)倍數(shù)，一個(gè)是底片倍數(shù)，一個(gè)是顯示倍數(shù)。底片倍數(shù)，指掃描電鏡獲取圖像時(shí)，實(shí)際拍攝到5英寸底片上的放大倍數(shù)。顯示倍數(shù)是指在顯示器上顯示的放大倍數(shù)。初學(xué)者搞不清楚底片倍數(shù)和顯示倍數(shù)的區(qū)別，同樣的細(xì)節(jié)長(zhǎng)度，顯示倍數(shù)通常會(huì)比底片倍數(shù)高2-3倍，因此，衡量物體尺寸的大小看標(biāo)尺刻度，而不是放大倍數(shù)。
SEM的基本維護(hù)包括定期檢查放大倍率的校準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品（如光柵網(wǎng)格）進(jìn)行成像。對(duì)圖像上的特征進(jìn)行測(cè)量，并與給定的放大倍率或刻度條進(jìn)行比較，以確保達(dá)到正確的尺寸。如果不正確，可以遵循校準(zhǔn)程序。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下，屏幕上顯示的放大倍數(shù)可能包含2-5%的誤差。在許多情況下，這種不確定性是可以接受的。但是，如果所做的工作需要很高的精確度（尤其是半導(dǎo)體行業(yè)的精確測(cè)量），則必須使用與實(shí)驗(yàn)條件完全相同的條件和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)校準(zhǔn)系統(tǒng)，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的特征應(yīng)與您希望在實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的特征的尺寸密切匹配。例如，如果需要測(cè)量直徑為 500nm 的顆粒大小，校準(zhǔn)樣品應(yīng)包含相同大小的特征。
2.7 掃描速率和信噪比
如果需要采集高質(zhì)量的圖像，以供日后使用或出版時(shí)，通常會(huì)降低掃描速率。較慢的掃描速率可以在電子束掃描線上的每個(gè)像素點(diǎn)收集到更多的電子。這樣可以生成質(zhì)量更好的圖像。
SEM的圖像質(zhì)量受束斑大小和信噪比的限制。信噪比是電子束產(chǎn)生的信號(hào)（S）與儀器電子設(shè)備在顯示該信號(hào)時(shí)產(chǎn)生的噪聲（N）之比（S/N）。噪聲脈沖來(lái)源于電子束亮度、聚光透鏡設(shè)置（束斑尺寸）和 SE 探測(cè)器靈敏度，可能會(huì)給圖像帶來(lái)類似顆粒感。當(dāng)SEM參數(shù)設(shè)置為高分辨率成像時(shí)，其信噪比通常較低，因此會(huì)出現(xiàn)顆粒感，這可能是不可避免的。隨著每個(gè)圖像點(diǎn)記錄的電子總數(shù)的增加，SEM的圖像質(zhì)量和信噪比也會(huì)隨之提高。
圖19 左圖隨著信噪比的增加，圖像質(zhì)量也會(huì)提高
鎢（W）燈絲的特點(diǎn)是亮度低，導(dǎo)致成像的電子束流密度低。因此，在聚光透鏡設(shè)置為高分辨率成像時(shí)（小束斑尺寸），到達(dá)試樣的電子數(shù)量較少。因此，SE 產(chǎn)量低，為了生成高質(zhì)量的圖像，必須使用大束流，這就彌補(bǔ)了信噪比的不足，但同時(shí)也帶來(lái)了分辨率的下降。為了克服 W 燈絲的亮度限制并提高信噪比，人們開(kāi)發(fā)了場(chǎng)發(fā)射槍 (FEG) 等明亮相干光源。
2.8 圖像的假象：像散/邊緣效應(yīng)/充電效應(yīng)/電子束損傷和污染
要獲得的圖像，需要基礎(chǔ)理論知識(shí)和實(shí)踐，并且需要在許多因素之間進(jìn)行權(quán)衡。這個(gè)過(guò)程可能會(huì)遇到一些棘手的問(wèn)題。
像散
像散是圖像中難精確校正的調(diào)整之一，需要多加練習(xí)。下圖中間的圖像是經(jīng)過(guò)像散校正的正確聚焦圖像。左圖和右圖是像散校正不佳的例子，表現(xiàn)為圖像出現(xiàn)拉伸的條紋。
為實(shí)現(xiàn)精確成像，電子束（探針）到達(dá)試樣時(shí)的橫截面應(yīng)為圓形。探針的橫截面可能會(huì)扭曲，形成橢圓形。這是由一系列因素造成的，如加工精度和磁極片的材料、鐵磁體鑄造中的缺陷或銅繞組。這種變形稱為像散，會(huì)導(dǎo)致聚焦困難。
嚴(yán)重的像散可表現(xiàn)為圖像中X方向的"條紋"，當(dāng)圖像從對(duì)焦不足到對(duì)焦過(guò)度時(shí)，條紋會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)?nbsp;Y 方向。在精確對(duì)焦時(shí)，條紋會(huì)消失，如果束斑大小合適，就能正確對(duì)焦。
圖20 像散示意圖，完全消除像散的圖片如中間所示
為了使探針呈圓形，需要使用像散校正器。這包括以四邊形、六邊形或八邊形方向放置在鏡筒周圍的電磁線圈。這些線圈可以調(diào)整電子束的形狀，并可用于校正任何重大的透鏡變形。
在放大 10,000 倍左右的情況下，將物鏡調(diào)整到欠焦或過(guò)焦時(shí)，如果圖像在一個(gè)方向或另一個(gè)方向上沒(méi)有條紋，則一般認(rèn)為圖像沒(méi)有像散。在1000倍以下的圖像中，像散通常可以忽略不計(jì)。
校正像散的方法是將X和Y像散器設(shè)置為零偏移（即不進(jìn)行像散校正），然后盡可能精細(xì)地對(duì)焦樣品。然后調(diào)整X 或Y消像散器控制（不能同時(shí)調(diào)整）以獲得圖像，并重新對(duì)焦。
邊緣效應(yīng)
邊緣效應(yīng)是由于試樣邊緣的電子發(fā)射增強(qiáng)所致。邊緣效應(yīng)是由于形貌對(duì)二次電子產(chǎn)生的影響造成的，也是二次電子探測(cè)器產(chǎn)生圖像輪廓的原因。電子優(yōu)先流向邊緣和峰頂，并從邊緣和峰頂發(fā)射，被探測(cè)器遮擋的區(qū)域，如凹陷處，信號(hào)強(qiáng)度較低。樣品朝向探測(cè)器區(qū)域發(fā)射的背向散射電子也會(huì)增強(qiáng)形貌襯度。降低加速電壓可以減少邊緣效應(yīng)。
圖21 邊緣效應(yīng)產(chǎn)生示意圖
電子在樣品中聚集并不受控制地放電會(huì)產(chǎn)生充電現(xiàn)象，這會(huì)產(chǎn)生不必要的假象，尤其是在二次電子圖像中。當(dāng)入射電子數(shù)大于從樣品中逸出的電子數(shù)時(shí)，電子束擊中樣品的位置就會(huì)產(chǎn)生負(fù)電荷。這種現(xiàn)象被稱為"充電Charging"，會(huì)導(dǎo)致一系列異常效果，如襯度異常、圖像變形和偏移。有時(shí)，帶電區(qū)域的電子突然放電會(huì)導(dǎo)致屏幕上出現(xiàn)明亮的閃光，這樣就無(wú)法捕捉到襯度均勻的樣品圖像，甚至?xí)?dǎo)致小樣品從樣品臺(tái)上脫落。
充電效應(yīng)的程度與 (1) 電子的能量和 (2) 電子的數(shù)量有關(guān)。電子的能量與加速電壓有關(guān)，因此降低加速電壓可以減少充電。電子的數(shù)量與許多參數(shù)有關(guān)，包括束流、電子槍的種類、束斑大小以及電子槍和試樣之間的光闌。因此，通過(guò)調(diào)整這些參數(shù)來(lái)減少電子數(shù)也可以減少充電效應(yīng)。
圖22 橫向的亮暗帶是充電的結(jié)果
要解決不導(dǎo)電樣品的充電問(wèn)題，在樣品制備方法上是在樣品上鍍上一層較厚的金或鉑薄膜，這樣做是為了提高表面的導(dǎo)電性，使足夠的電子能夠逸出，避免表面充電和損壞。顆粒等松散材料經(jīng)常會(huì)受到充電的影響，在實(shí)際操作上，這些樣品都通過(guò)磁控濺射鍍膜儀來(lái)鍍上一層厚3-10nm的金屬層。
圖23 鋰電池干法隔膜。上圖，不鍍膜，即使在500V低電壓下，T2探測(cè)器成像存在明顯的充電效應(yīng)，隔膜形態(tài)無(wú)法辨別。下圖，鍍膜后，可以很好的緩解充電效應(yīng)，用T2能拍清楚隔膜表面細(xì)節(jié)輪廓和孔隙的大小，插圖為AFM圖，可以證實(shí)，濺射的過(guò)程并沒(méi)有對(duì)隔膜造成損傷，保持了較真實(shí)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。
圖24 鋰電池隔膜。除了鍍膜處理，采用Apreo2的T1探測(cè)器可以直接對(duì)隔膜成像，相比鍍膜后的效果，表面細(xì)節(jié)可以辨別，但還不夠清晰。
此外，在相同的電鏡參數(shù)條件下，比如都是低加速電壓成像，合理的選擇探測(cè)器，也有助于緩解荷電效應(yīng)。從上面的隔膜樣品就能看出來(lái)，同樣的參數(shù)T2和T1探測(cè)器，對(duì)充電效應(yīng)的敏感程度是不一樣的。
圖25 樹(shù)脂溶液中的橡膠納米粒子，不鍍金。即使選擇Apreo2電鏡的T2探測(cè)器在1KV下成像，但依舊存在充電效應(yīng)。切換到T1探測(cè)器，不僅能避免充電效應(yīng)，還能準(zhǔn)確測(cè)量出溶液中的納米顆粒尺寸。
此外，除了低加速電壓成像，具有低真空功能的SEM或環(huán)境SEM (ESEM) 可用于控制充電效應(yīng)。
用電子束輻照試樣會(huì)導(dǎo)致電子束能量以熱量的形式流失到試樣中。較高的加速電壓會(huì)導(dǎo)致輻照點(diǎn)的溫度升高，這可能會(huì)損壞（如熔化）聚合物或蛋白質(zhì)等易碎試樣，并蒸發(fā)蠟或其他試樣成分，同時(shí)也會(huì)污染鏡筒。
解決辦法是降低電子束能量，增加工作距離也有幫助，因?yàn)樵谙嗤碾娮邮芰肯拢梢栽跇悠飞袭a(chǎn)生更大的束斑，但這樣做的缺點(diǎn)是會(huì)降低分辨率。
與電子束相關(guān)的污染是指在電子束掃描過(guò)的樣品區(qū)域沉積材料（如碳），這是電子束與真空室中的氣態(tài)分子（如碳?xì)浠衔铮┫嗷プ饔玫慕Y(jié)果。
解決這種假象的方法之一是先用低倍放大鏡拍攝顯微照片，然后再用高倍放大鏡拍攝。在將樣品放入SEM腔室之前，確保樣品盡可能干凈，或者采用等離子清洗樣品，也可以減少這種假象。對(duì)于場(chǎng)發(fā)射電鏡而言，在處理樣品時(shí)通常需要戴上手套，以防止被手指油脂等污染。
圖26 采用等離子清洗，消除樣品表面污染和假象
總之，獲得滿意的SEM圖片需要綜合考慮樣品制備、儀器設(shè)置和圖像處理等方面的因素。在樣品制備過(guò)程中，需要選擇合適的樣品、清洗方法和干燥方法。在儀器參數(shù)設(shè)置過(guò)程中，需要選擇合適的加速電壓、工作距離和探測(cè)器類型等。在圖像處理過(guò)程中，需要選擇合適的圖像增強(qiáng)、信號(hào)過(guò)濾方法。此外，還要考慮像散/邊緣效應(yīng)/充電效應(yīng)/電子束損傷和污染的因素。
通過(guò)綜合考慮并權(quán)衡這些因素，可以獲得高質(zhì)量的SEM圖像，從而提高對(duì)材料的分析和理解水平。
